Makoto Nabetani, Haruo Shintaku & Takashi Hamazaki – Pediatric Research, Zveřejněno: 8. 11. 2017

Původní zdroj: https://www.nature.com/articles/pr2017260

Abstrakt

Novorozenecké ischemické poškození mozku způsobuje trvalou mozkovou obrnu s motorickým deficitem. Hypoxicko-ischemická encefalopatie (HIE) je velmi závažný stav, který může vést ke smrti a postižení. V roce 1997 jsme uvedli, že nevratné poškození neuronálních buněk je vyvoláno zvýšením intracelulární koncentrace Ca iontů, ke kterému došlo postupně po nadměrné akumulaci excitačního neurotransmiteru glutamátu během ischemie. Rovněž jsme uvedli, že hypotermie je účinná při léčbě ischemického poškození mozku u potkanů tím, že potlačuje energetické ztráty a zvyšuje intracelulární koncentraci Ca iontů. V návaznosti na revidované pokyny Mezinárodního styčného výboru pro resuscitaci z roku 2010 naše skupina vypracovala Pokyny pro léčbu hypotermie v Japonsku a v lednu 2012 jsme zahájili online registr případů. Terapeutická hypotermie však musí být zahájena během prvních 6 h po porodu. Naproti tomu buněčná terapie může mít mnohem delší terapeutické časové okno, protože může snížit apoptózu/oxidační stres a posílit regenerační proces. V roce 2014 jsme poprvé v Japonsku podali autologní terapii kmenovými buňkami z pupečníkové krve (UCBC) u novorozenecké HIE. Zařadili jsme pět donošených novorozenců se středně těžkou až těžkou HIE. Naše autologní terapie UCBC vede k novým protokolům pro prevenci ischemického poškození mozku.

###

Přestože se novorozenecká úmrtnost v posledních desetiletích celosvětově výrazně snížila, mezi mnoha zeměmi stále existují velké rozdíly (1). V Japonsku došlo za posledních 30 let k výraznému poklesu novorozenecké úmrtnosti – z 2,7/100 000 na 1,0/100 000 porodů, což je podobné jako v jiných zemích s vyspělým zdravotnickým systémem. Prevalence dětské mozkové obrny (DMO) v důsledku předčasného a termínového ischemického poškození mozku však zůstává již několik desetiletí stejná, a to i ve vysoce rozvinutých zemích (2, 3, 4). Novorozenecké poškození mozku u donošených dětí je způsobeno především novorozeneckou hypoxicko-ischemickou encefalopatií (HIE), vrozenou anomálií a mozkovým infarktem, zatímco novorozenecké poškození mozku u nedonošených dětí je způsobeno především periventrikulární leukomalacií (PVL) a intraventrikulárním krvácením (5). HIE u donošených dětí je obzvláště závažný stav; vyskytuje se odhadem u 0,5-2/1 000 živě narozených dětí a má za následek smrt a postižení (6, 7, 8). V minulosti více než polovina středně těžkých až těžkých případů novorozenecké HIE vedla k trvalému motorickému deficitu CP a CP byla často doprovázena dalšími závažnými komplikacemi, jako je ztráta sluchu, poruchy zraku, epilepsie, hydrocefalus, intelektuální postižení a poruchy chování (9). V posledních letech se však jako první účinná terapie novorozenců s HIE prosadila terapeutická hypotermie mozku (10, 11, 12). Kromě toho se do nových protokolů na ochranu před ischemickým poškozením mozku začleňují buněčné terapie, jako jsou kmenové buňky z pupečníkové krve (UCBC), kmenové buňky z kostní dřeně (KD) a mezenchymální kmenové buňky odvozené z pupečníku/KD (BM-MSC).

Mechanismus neonatální HIE

V roce 1969 Olney (13, 14) objevil excitotoxicitu a prokázal, že přinejmenším část smrti nervových buněk způsobené hypoxií a ischémií je zprostředkována nadměrnou produkcí excitačního neurotransmiteru glutamátu. Na rozdíl od zkušeností s hypoxicko-ischemickými inzulty u dospělých neonatologové zjistili, že u některých kojenců, kteří se po těžké asfyxii hladce zotavili, došlo následně k rychlému zhoršení stavu a o několik dní později zemřeli. Po několik desetiletí nebyla k dispozici žádná účinná léčba takového poškození mozku. V 80. letech 20. století vědci zaznamenali fenomén opožděné smrti neuronů (15, 16). V 90. letech 20. století potvrdila skupina Osmunda Reynoldse fenomén opožděné neuronální smrti novorozenců po hypoxických ischemických inzultech, nazývaný „sekundární energetické selhání“, pomocí sofistikovaného přístupu fosforové magnetické rezonance, který umožnil replikovat komplikovaný proces u selat a mláďat potkanů (17, 18, 19, 20).

V roce 1984 Olney a jeho spolupracovníci (21) změnili paradigma a navrhli, že hypoxicko-ischemické poškození lze léčit blokováním N-methyl-D-aspartátu, a navrhli, že jeho farmakologická blokáda může poskytnout dobrou ochranu před neonatálním hypoxicko-ischemickým poškozením mozku. Bohužel blokátor N-methyl-D-aspartátových receptorů a další léky, jako je síran hořečnatý a antagonisté kalciových kanálů, nebyly klinicky účinné (22, 23). V roce 1997 jsme uvedli, že ireverzibilní poškození neuronálních buněk bylo vyvoláno zvýšením intracelulární koncentrace Ca iontů v důsledku nadměrné akumulace excitačního neurotransmiteru glutamátu u nezralých a dospělých potkanů během ischemie a glukózové deprivace (24). Klíčová role volných radikálů, které vedou k nevratnému poškození buněk, byla generována ve značné části procesů aktivovaných Ca2+ (25, 26, 27, 28, 29, 30). Z klinického hlediska je však nemožné přesně určit načasování těchto mechanismů a určit, který mechanismus určuje závažnost HIE u lidských novorozenců (31, 32).

V roce 1989 Busto a spol. prokázali (33), že mírná hypotermie po hypoxicko-ischemickém inzultu u dospělých potkanů snižuje uvolňování neurotransmiterů a má ochranný účinek na poškození hipokampálních neuronů. V roce 1996 Thoresen et al. (34) a Sirimanne et al. (35)reprodukovali ochranný účinek hypotermie proti poškození mozku u novorozených potkanů. Uváděli jsme, že léčba hypotermií byla účinnou léčbou hypoxického nebo ischemického poškození mozku u potkanů potlačením energetických ztrát a zvýšením intracelulární koncentrace Ca iontů (36).

Mechanismus terapie kmenovými buňkami jako regenerační léčby novorozenecké HIE

Nedávné experimentální studie na zvířecích modelech naznačily, že do procesu, kterým UCBC chrání mozek před hypoxicko-ischemickým poškozením, jsou zapojeny různé mechanismy účinku. Lze také očekávat, že budou zlepšovat zotavení po poškození mozku. Proces poškození mozku se dělí do pěti fází: (1) vyčerpání energie, (2) zánět, (3) excitotoxicita, (4) oxidační stres a (5) apoptóza (obrázek 1) (27, 28, 29). Předpokládá se, že terapie kmenovými buňkami z pupečníkové krve poskytuje ochranný účinek především na (2) zánět, (4) apoptózu a (5) oxidační stres a také posiluje regeneraci.

Novorozenecké poškození mozku při hypoxicko-ischemické encefalopatii

Imunomodulační/protizánětlivý účinek

Zatím není známo, která složka pupečníkové krve je nejúčinnější při léčbě zánětu způsobeného poraněním mozku. Specifické buněčné populace, které se nacházejí v pupečníkové krvi a tkáni, jako jsou MSC a endoteliální progenitorové buňky, prokázaly potenciální užitečnost pro zmírnění zánětlivého procesu vyvolaného poraněním mozku. MSC mají silné imunomodulační účinky a chrání před globálními a lokálními neurozánětlivými kaskádami vyvolanými hypoxicko-ischemickými událostmi (37, 38, 39). Některé zprávy naznačují, že podávání UCBC také snižuje poškození bílé hmoty po hypoxicko-ischemickém inzultu, a to prostřednictvím kombinace protizánětlivých a dalších účinků (40).

Snížení apoptózy a oxidačního stresu

Hattori uvádí, že jednorázová intraperitoneální injekce mononukleárních buněk odvozených od UCBC 6 h po ischemickém inzultu byla spojena s přechodným snížením počtu buněk pozitivních na apoptózu a markery oxidačního stresu, ale nevyvolala dlouhodobou morfologickou ani funkční ochranu (41, 42, 43).

Posílení regeneračního procesu sekrecí různých cytokinů

Bylo prokázáno, že lidské CD34+ buňky vylučují různé růstové faktory, jako je neurotrofický faktor odvozený od mozku, neurotrofický faktor odvozený od gliových buněčných linií, vaskulární endoteliální růstový faktor a četné angiogenní faktory, včetně hepatocytárního růstového faktoru a inzulínu podobného růstového faktoru-1 (44, 45, 46, 47).

Posílení regeneračního procesu pomocí angiogeneze pro lepší prokrvení mozku

V roce 2004 Taguchi et al. (48, 49) uvedli, že po cévní mozkové příhodě poskytují CD34+ buňky příznivé prostředí pro regeneraci neuronů, což naznačuje zásadní roli CD34+ buněk v přímé či nepřímé podpoře prostředí příznivého pro neovaskularizaci ischemického mozku. Je zřejmé, že cirkulující endoteliální progenitorové buňky v populacích CD34+ buněk obohacených v pupečníkové krvi mají schopnost podílet se na neovaskularizaci ischemické tkáně u novorozenců (50, 51). Endoteliální progenitorové buňky mají angiogenní a cévní reparační schopnosti, které je činí ideálními pro neurovaskulární reparaci (52, 53). Takové bohaté cévní prostředí spolu s tvorbou dalších pečujících neuronálních mediátorů z CD34+ buněk, jako je vaskulární endoteliální růstový faktor, epidermální růstový faktor 2 a inzulinu podobný růstový faktor 1-1 (cit.54, 55), zvyšuje následnou regeneraci neuronů. Endogenní neurogeneze je urychlena příchodem neuronálních progenitorů do poškozené oblasti a následně jejich dozráváním a přežíváním, když CD34+ buňky nadále stimulují tvorbu cévních kanálů (47, 56).

Posílení regeneračního procesu neurogenezí

Bylo prokázáno, že nervové kmenové/progenitorové buňky se podílejí na regenerační odpovědi na perinatální hypoxii-ischemii (57). Jeden článek uvádí, že hematopoetické kmenové buňky se mohou diferencovat v nelymfopoetické buňky, jako jsou neurony nebo mikroglie, nebo mohou stimulovat neurogenezi (58). Není však jisté, zda je to u novorozenců s HIE významně účinné (59, 60, 61, 62, 63).

Rámec ochranné léčby novorozenců v Japonsku

Na počátku 21. století se u novorozenců s HIE začala používat terapeutická hypotermie (TH). V roce 2005 byly provedeny tři rozsáhlé randomizované kontrolované studie, které prokázaly proveditelnost a účinnost TH (ref. (10, 11, 12)). Kromě toho revidované pokyny Mezinárodního styčného výboru pro resuscitaci z roku 2010 od Perlmana a spolupracovníků (64) uvádějí, že novorozencům narozeným v termínu nebo blízko termínu s rozvíjející se středně těžkou až těžkou HIE by měla být nabídnuta TH. V Japonsku byla TH zahájena v roce 1999. Do roku 2010 však převažovaly různé empirické přístupy a počet center schopných poskytovat standardní chlazení byl v té době nedostatečný (obrázek 2). Proto jsme v srpnu 2010 provedli primární celonárodní průzkum praxe TH, abychom zjistili stav praxe v Japonsku. Dotazníky byly zaslány všem registrovaným jednotkám intenzivní péče o novorozence II./III. stupně a odpovědi byly získány z 203 z 242 jednotek (83,9 %) (65). Pouze 89 zařízení (43,8 %) uvedlo, že poskytují TH. Počet novorozenců s HIE v roce 2009 na novorozeneckých jednotkách intenzivní péče II./III. stupně byl 486 případů. Počet ochlazených kojenců v roce 2009 byl 234.

Počet chladicích center v Japonsku pro léčbu kojenců s hypoxicko-ischemickou encefalopatií

Tyto výsledky naznačují, že přibližně polovina novorozenců s HIE nemusela mít v roce 2010 z TH žádný prospěch. Proto jsme v Japonsku založili pracovní skupinu pro novorozeneckou hypotermii a v roce 2011 jsme na základě randomizovaných kontrolovaných studií vypracovali Pokyny pro léčbu hypotermie v Japonsku (ref. (66)). Poté jsme uspořádali několik workshopů a konsenzuálních setkání k formulaci klinických doporučení, po nichž následovalo vydání praktických učebnic a rozsáhlé vzdělávací semináře. V lednu 2012 jsme zahájili online registr případů. Zjištění z následného průzkumu v lednu 2013 byla porovnána s výsledky primárního průzkumu (míra odpovědí: 89,1 %). Počet chladicích center se zvýšil z 89 na 135. Dvanáct ze 47 prefektur nemělo v roce 2010 žádné chladicí centrum, zatímco v roce 2013 mělo všech 47 prefektur alespoň jedno. V chladicích centrech se dodržování standardních chladicích protokolů a používání servořízených chladicích zařízení zlepšilo z 20,7 % na 94,7 %, resp. ze 79,8 % na 98,5 %. K prosinci 2016 bylo zaznamenáno 900 případů (> 200 případů/rok) a 167 chladicích zařízení. Bylo dosaženo rychlého zlepšení národního poskytování TH založeného na důkazech. Naše důrazné intervence v souladu s mezinárodními konsenzuálními pokyny by mohly být účinné při posunu empirických přístupů k praxi založené na důkazech (67).

Abychom prozkoumali klinické využití TH, analyzovali jsme údaje shromážděné během prvních tří let (2012-2014) japonského registru chlazení dětí (67). Ze 485 chlazených novorozenců jich 96,5 % bylo ve ≥ 36. týdnu těhotenství; 99,4 % vážilo ≥ 1 800 g. Kromě toho 96,7 % vyžadovalo resuscitaci po dobu >10 min. Encefalopatie II. a III. stupně byla patrná u 61,1 %, resp. 27,2 %. Úmrtnost byla 2,7 %; 90,7 % bylo propuštěno domů. Apgar skóre a závažnost acidózy/encefalopatie se v průběhu času neměnily: 1 (1 min), 4 (5 min) a 5 (10 min) a pH (6, 68). Doba do dosažení cílové teploty byla v roce 2014 kratší než v roce 2012. Úmrtnost, doba trvání mechanické ventilace a požadavek na výživu sondou při propuštění se nezměnily. Míra úmrtnosti v našem souboru (2,7 %) byla výrazně nižší než míra úmrtnosti uváděná v předchozích studiích (CoolCap (33 %), NICHD (24 %) a UK TOBY (26 %)), a to i přes použití podobných kritérií pro zařazení (10, 11, 12). Novější klinická studie prokázala nižší krátkodobou úmrtnost (7 %) u novorozenců, kteří byli randomizováni k celotělovému chlazení na 33,5 °C po dobu 72 hodin (69). To lze přičíst rozdílnému postoji k odpojení přístrojů pro podporu života u novorozenců s velmi těžkým poškozením mozku. K objasnění faktorů souvisejících s krátkodobými a dlouhodobými výsledky u chlazených novorozenců je zapotřebí provést celosvětové srovnávací studie. TH má však následující omezení:

1) Příležitost k léčbě je ∼6 hodin po porodu a časnější léčba po porodu je účinnější.

2) Počet potřebný k léčbě je ∼9, a tak mnoho dětí stále umírá nebo přežívá s postižením.

Nedávná randomizovaná kontrolovaná studie navíc prokázala, že delší chlazení a/nebo chlazení při nižších teplotách ve srovnání s hypotermií při teplotě 33,5 °C po dobu 72 h nesnížilo úmrtnost na novorozenecké jednotce intenzivní péče u donošených novorozenců se středně těžkou nebo těžkou HIE (69).

Klinické použití UCBCs terapie ischemického poškození mozku

V roce 1982 Nakahata a Ogawa (70) uvedli, že UCB (pupečníková krev) obsahuje bohaté kmenové buňky, jako jsou hematopoetické a MSC. Povrchový antigen CD34 byl široce používán jako marker hematopoetických kmenových a endoteliálních progenitorových buněk. UCB obsahuje ∼0,3-2 % CD34+ buněk, zatímco periferní krev dospělých lidí obsahuje <0,01 % CD34+ buněk (71, 72, 73, 74, 75). Terapeutické účinky UCB byly již dříve prokázány u hematologických onemocnění, jako je leukémie, Fanconiho anémie a aplastická anémie, a v posledních několika desetiletích nahradily používání krvetvorných kmenových buněk (76, 77, 78). V posledních letech však byly UCB identifikovány jako zdroj endoteliálních kmenových/progenitorových buněk a jako zdroj s účinkem na různá neřešitelná onemocnění, včetně CP, diabetes mellitus a srdečních, cévních a jaterních onemocnění. Různé typy kmenových buněk jsou možnými zdroji buněčné terapie pro klinické aplikace, zejména u neurologických onemocnění (79, 80). Níže upozorňujeme na potenciální terapeutické účinky buněčných terapií, zejména na terapii ischemické choroby autologní pupečníkovou krví, která v posledních desetiletích výrazně pokročila.

V roce 2006 Meier et al. (81) uvedli účinnost intraperitoneální infuze UCBC u potkanů s neonatální hypoxií. Kurtzberg a jeho spolupracovníci (82) na Duke University ve Spojených státech provádějí studii fáze II pro CP s použitím autologních UCBC. V roce 2011 Cox a spol (82) informovali o studii proveditelnosti, která ukázala, že autologní mononukleární buňky BM je logisticky možné a bezpečné předepisovat intravenózně dětem s traumatickým poškozením mozku. Deseti dětem ve věku 5 až 14 let, které měly poresuscitační skóre na Glasgow Coma Scale 5 až 8, bylo podáno 6 × 10 autologních mononukleárních buněk BM na kg tělesné hmotnosti intravenózně do 48 hodin po traumatickém poranění mozku. Všichni pacienti přežili. Konvenční magnetická rezonance porovnávající objemy šedé a bílé hmoty a mozkomíšního moku neprokázala v období 1 až 6 měsíců po úrazu žádné zmenšení. Dichotomizované Glasgow Outcome Score po 6 měsících ukázalo 70 % s dobrými výsledky a 30 % se středně těžkým až těžkým postižením.

Wang et al. (83) v roce 2013 informovali o klinické studii s použitím BM-MSC u pacientů s CP. Naznačili, že autologní transplantace BM-MSC může být proveditelnou, bezpečnou a účinnou léčbou pacientů s CP. Tato léčba zlepšila vývoj motorických funkcí u dětí s CP (84). Po poskytnutí informovaného souhlasu podstoupilo transplantaci BM-MSC 52 pacientů s CP, kteří splňovali kritéria studie. Hrubá motorika byla hodnocena na počátku (před transplantací) a po 1 měsíci, 6 měsících a 18 měsících po transplantaci. Skóre hrubé motoriky v doménách A, B, C a D a celkové skóre se u účastníků zvýšilo po 1 měsíci, 6 měsících a 18 měsících po transplantaci ve srovnání s výchozí hodnotou (P<0,01). Skóre domény E se rovněž zvýšilo 6 a 18 měsíců po transplantaci. Skóre hrubé motoriky se po transplantaci buněk významně zvýšilo.

V roce 2015 provedli Sharma et al. (84) otevřenou nerandomizovanou studii u 40 pacientů s CP, jejímž cílem bylo zhodnotit přínos buněčné terapie v kombinaci s rehabilitací. Tito pacienti dostávali autologní mononukleární buňky BM intratekálně. Sledování probíhalo 1 týden, 3 měsíce a 6 měsíců po intervenci. Celkově došlo po 6 měsících ke zlepšení u 95 % pacientů. Studijní populace byla dále rozdělena na diplegiky, kvadruplegiky a různé skupiny. Na základě statistické analýzy byla zjištěna významná souvislost mezi buněčnou terapií a symptomatickým zlepšením u diplegických a kvadruplegických CP. Skeny pozitronové emisní tomografie a počítačové tomografie provedené u šesti pacientů prokázaly metabolické zlepšení v oblastech mozku korelující s klinickým zlepšením. Výsledky této studie ukazují, že buněčná terapie může urychlit vývoj, snížit postižení a zlepšit kvalitu života pacientů s CP (84).

Bylo také zjištěno, že současné podávání alogenních UCBC a rekombinantního lidského erytropoetinu může zvýšit účinnost UCBC a zlepšit motorickou a kognitivní dysfunkci u dětí s CP podstupujících aktivní rehabilitaci, kterou provázejí strukturální a metabolické změny v mozku (85). Studii dokončilo celkem 96 subjektů. Ve srovnání se skupinou s rekombinantním lidským erytropoetinem (n=33) a kontrolní skupinou (n=32) měla skupina s rekombinantním lidským erytropoetinem a alogenními UCBCs (n=31) v 6 měsících významně vyšší skóre v měření hrubé motoriky a v Bayleyově škále dětského vývoje-II mentální a motorické škály. Difuzní tenzorové obrazy odhalily významné korelace mezi přírůstkem hrubé motorické výkonnosti a změnami frakční anizotropie ve skupině s rekombinantním lidským erytropoetinem a alogenními UCBCs. Pozitronová emisní tomografie s 18F-fluorodeoxyglukózou a počítačová tomografie ukázaly rozdílné vzorce aktivace a deaktivace mezi třemi skupinami.

Sto osmdesát pacientů s diplegií a kvadruplegií po úrazu podstoupilo v Indii v období od prosince 2005 do října 2007 subarachnoidální umístění kmenových buněk. U 102 (56,6 %) pacientů byly pozorovány nežádoucí účinky (bolesti hlavy, nízká horečka a meningismus), které odezněly při symptomatické léčbě do 24 h. U 32 % pacientů byla léčba účinná, bez krátkodobých i dlouhodobých nežádoucích účinků. Při dlouhodobém sledování došlo ke zlepšení funkčních ukazatelů u 57 (31,67 %) pacientů: U 54 pacientů s traumatickou paraplegií/kvadriplegií, 2 pacientů s CP a 1 pacienta s virovou encefalitidou (86).

Nedávno Mancías-Guerra et al. (87) informovali o otevřené studii fáze I, jejímž cílem bylo zjistit bezpečnost a snášenlivost intratekálního podání autologních jaderných buněk BM u dětí s CP. Bylo zkoumáno osmnáct dětských pacientů s CP s cílem posoudit bezpečnost intratekální a intravenózní aplikace autologních celkových nukleovaných buněk BM po stimulaci faktorem stimulujícím kolonie granulocytů. Bylo pozorováno celkové zvýšení vývojového věku podle Battelle Developmental Inventory, zahrnující všechny oblasti hodnocení, o 4,7 měsíce (±SD 2,63). Nebyly zjištěny žádné změny na magnetické rezonanci po 6 měsících sledování. Subarachnoidální umístění autologních celkových jaderných buněk odvozených z BM u dětí s CP je bezpečný postup.

Ve srovnání s buňkami odvozenými z BM jsou UCBC snadno dostupné, pokud jsou adekvátně odebrány a skladovány. Buněčná terapie s využitím UCBCs se rozšiřuje o nové aplikace. Rizk et al. (88) v přehledovém článku uvádí, že nejčastější indikací pro terapii UCB jsou neurologická onemocnění (25 studií), včetně CP (12 studií). Mezi další indikace patří diabetes mellitus (9 studií), srdeční a cévní onemocnění (7 studií) a jaterní onemocnění (4 studie). Většina studií používala celkové nukleární buňky, mononukleární buňky nebo CD34+ buňky (31 studií); 20 studií používalo MSC odvozené z pupečníkové krve. Čtyřicet šest studií popisovalo buněčné produkty získané z alogenních zdrojů a 11 studií používalo autologní produkty. Rizk et al (88) identifikovali tři indikace, pro které bylo publikováno více prospektivních kontrolovaných studií (4 ze 4 uváděly klinický přínos u CP, 1 ze 3 uváděla přínos u cirhózy a 1 ze 3 uváděla biochemickou odpověď u diabetu 1. typu).

Budoucí perspektivy buněčné terapie novorozenecké HIE

Proveditelnost terapie autologní pupečníkovou krví

TH má určitá omezení v tom, že musí být zahájena během prvních 6 h po porodu. Nedávno byla zahájena randomizovaná kontrolovaná studie celotělové hypotermie po dobu 72 h u předčasně narozených dětí s gestačním stářím 33-35 týdnů, ale TH se zkoumá i u nedonošených dětí <33 týdnů. Naproti tomu buněčná terapie může mít mnohem delší terapeutická časová okna (89) a mohla by prokázat účinnost u ischemického poškození mozku donošených, téměř donošených a nedonošených novorozenců, včetně periventrikulární leukomalacie, intraventrikulárního krvácení a HIE. V současné době probíhá mnoho klinických studií, které zkoumají účinnost kmenových buněk při léčbě pacientů s perinatálním ischemickým poškozením mozku a CP. Kmenové buňky získané z tkáně pupečníku a pupečníkové krve, které se obvykle po porodu vyřazují, se ukazují jako bezpečná a potenciálně účinná léčba. Z těchto různých strategií buněčné terapie by intravenózní podání autologní terapie UCBC mohlo být nejbezpečnější a nejproveditelnější, protože UCB se již několik desetiletí používá k transplantaci hematopoetických kmenových buněk u pacientů s hematologickými onemocněními (90). UCB navíc obsahuje několik typů kmenových buněk, jako jsou hematopoetické kmenové buňky, endoteliální progenitorové buňky a MSC (91, 92). Odběr UCB je neinvazivní a autologní a použití UCBC je spojeno s menšími etickými problémy ve srovnání s alogenními nebo kultivovanými kmenovými buňkami, embryonálními kmenovými buňkami a indukovanými pluripotentními kmenovými buňkami, protože autologní UCB s sebou nenesou možnost nádorovosti nebo odmítnutí a nevyžadují složitý kultivační proces. Odběr, separace a skladování UCBC musí být pečlivě regulovány, protože je vyžadován screening na infekce. Navrhujeme, že autologní UCBC v kombinaci s TH by mohly být optimální terapií pro novorozence s HIE. Navrhujeme také, že autologní UCBC terapie by mohla být nejvhodnější léčbou pro předčasně narozené novorozence s periventrikulární leukomalacií nebo intraventrikulárním krvácením, kteří se narodili ve věku 24-33 týdnů.

Zkušenosti s autologní UCBC terapií v Japonsku

Cotten et al. (93) prokázali proveditelnost a potenciální účinnost autologní UCBC terapie novorozenecké HIE. V roce 2014 jsme založili japonskou výzkumnou skupinu Neonatal Encephalopathy Consortium pro autologní UCBC terapii novorozenecké HIE a začali jsme autologní UCBC terapii novorozenecké HIE používat. Jedná se o pilotní studii pro testování proveditelnosti a bezpečnosti terapie UCBC u novorozenců s neonatální HIE; studie je otevřená, s přiřazením jedné skupiny. Počet CD34+ buněk v periferní krvi novorozence se bezprostředně po porodu rychle snižuje a během prvních 48 hodin po porodu má tendenci dosáhnout základní úrovně (94). Než jsme přistoupili ke studii na lidech, zkoumali jsme životaschopnost a počet CD34+ buněk v UCB po automatické separaci mononukleárních buněk. UCB byly odebrány matkám, které předem udělily písemný informovaný souhlas s odběrem. Asepticky odebraný UCB byl zpracován pomocí přípravku Sepax (Biosafe, Eysins, Švýcarsko) ke snížení objemu a červených krvinek pro tři samostatné infuze. Bez kryokonzervace zůstal celkový počet a životaschopnost CD34+ buněk ve zpracovaném UCB po dobu 72 hodin nezměněn (obrázek 3). Koncentrace draslíku byla po 72 h rovněž stabilní, a to na medián 5,8 mEq/l (1,7-11,6). Protože Sepax vyžaduje pro normální zpracování objem alespoň 40 ml bez srážení, museli jsme stanovit vylučovací kritéria pro kojence, jejichž odebraný UCB měl objem < 40 ml nebo měl masivní srážení. Kromě toho jsou kritéria pro zařazení do naší probíhající studie autologního UCBC stejná jako kritéria pro zařazení/vyřazení do TH v Japonsku (68). Pokud se novorozenec narodí se známkami a příznaky středně těžké až těžké encefalopatie a splňuje kritéria pro TH, je zvažováno jeho zařazení do této klinické studie. Předpokládaný počet zařazených případů je šest. Abychom zajistili řádný odběr UCB bez kontaminace, vyloučíme ze studie novorozence narozené mimo domov. Pokud se kojenec narodí s těžkou asfyxií, odebírá se UCB bezprostředně po narození z pupečníkové žíly se zvláštní péčí, aby nedošlo ke kontaminaci. Před odběrem UCB získáváme souhlas rodičů. Objem UCB a červených krvinek se redukuje centrifugací v uzavřeném systému pomocí automatického přístroje (Sepax). UCB se sníženým objemem a červenými krvinkami obsahuje mnoho typů jaderných buněk, včetně různých kmenových buněk, jako jsou CD34+ hematopoetické kmenové/endoteliální progenitorové buňky. Zpracovaný UCB se rozdělí do tří dávek a do použití se uchovává při teplotě 4 °C. Dávka buněk se neupravuje. Celkové množství odebraných UCB se použije po výše uvedené jednoduché centrifugaci. Odhadované podané dávky by byly ∼6 × 108 buněk na novorozence.

Životaschopnost CD34+ buněk po separacii

Pokud je celkové množství UCB < 40 ml, novorozenec nebude do studie zařazen, protože automatizovaný proces UCB nemusí být spolehlivý, pokud je objem ke zpracování < 40 ml. Kvalitu zpracovaných a nekryokonzervovaných UCB jsme zkoumali pomocí UCB odebraných dobrovolníkům před zahájením této studie. Po 72 hodinách po zpracování nedošlo k růstu bakterií ani ke zvýšení draslíku a životaschopnost buněk byla dobře zachována. Písemný informovaný souhlas od rodičů získáváme dvakrát: poprvé, když po úvodním posouzení, což je obvykle několik hodin po narození, usoudíme, že novorozenec s HIE splňuje vstupní kritéria; podruhé před prvním podáním léčby UCBC novorozenci.

Autologní buňky z pupečníkové krve s redukovaným objemem se podávají intravenózně 12-24, 36-48 a 60-72 hodin po narození. Během léčby buňkami a po ní je pečlivě monitorován stav oběhu a dýchání. Primárním výsledným ukazatelem je míra výskytu nežádoucích účinků. Kombinovaná míra výskytu tří nežádoucích příhod ve 30 dnech věku – úmrtí, nepřetržitá podpora dýchání a nepřetržité užívání vazopresorů – bude porovnávána mezi novorozenci, kteří dostávají buněčnou terapii, a novorozenci s konvenční terapií včetně hypotermie. Sekundárním výsledným ukazatelem je účinnost. Neurozobrazení ve 12 měsících věku a neurovývojové funkce měřené pomocí Bayley III v 18 měsících věku budou porovnány mezi novorozenci, kteří dostávají buněčnou terapii, a novorozenci s konvenční terapií. Kojenci budou sledováni z hlediska bezpečnosti a výsledků neurologického vývoje až do 10 let věku.

Studovali jsme pět pacientů, kteří podstoupili autologní UCBC terapii v období od prosince 2014 do prosince 2016. Nezjistili jsme žádné významné nežádoucí účinky léčby. Profily pěti případů uvádíme v tabulce 1. Zařadili jsme jednoho pacienta s těžkou HIE a čtyři pacienty se středně těžkou HIE. U pacienta s těžkou HIE a u pacienta se středně těžkou HIE byly zjištěny abnormality na magnetické rezonanci mozku, ale všech pět pacientů přežilo do 1 roku. K prokázání účinnosti autologní UCBC terapie oproti léčbě pouze TH jsou zapotřebí další randomizované klinické studie.

Tabulka 1: Profily pacientů v pilotní studii USBC

Závěr

Buněčné terapie, jako jsou autologní UCBC a kmenové buňky BM, pupečníkové/BM-MSC a další kmenové buňky, vedou k novým protokolům pro prevenci ischemického poškození mozku. Očekává se, že další preklinické studie povedou k optimalizaci léčebného protokolu, a k prokázání bezpečnosti a účinnosti jsou zapotřebí multicentrické klinické studie.

Reference

1. Saugstad OD . Reducing global neonatal mortality is possible. Neonatology2011;99:250–257.
2. Touyama M, Touyama J, Toyokawa S, Kobayashi Y . Trends in the prevalence of cerebral palsy in children born between 1988 and 2007 in Okinawa, Japan. Brain Dev2016;38:792–9.
3. Koterazawa K, Okada Y, Miyata H . Incidence of cerebral palsy in Himeji over a 25-year period [Japanese]. No To Hattatsu2016;48:14–9.
4. Glinianaia SV, Best KE, Lingam R, Rankin J . Predicting the prevalence of cerebral palsy by severity level in children aged 3 to 15 years across England and Wales by 2020. Dev Med Child Neurol2017;59:864–70.
5. Volpe JJ . Hypoxic–ischemic encephalopathy: neuropathology and pathogenesis. In. Neurology of the Newborn5th edn. Amsterdam: Elsevier, 2008: 347–399.
6. Hayakawa M, Ito Y, Saito S et al. Incidence and prediction of outcome in hypoxic–ischemic encephalopathy in Japan. Pediatr Int2014;56:215–221.
7. Pierrat V, Haouari N, Liska A et al. Prevalence, causes, and outcome at 2 years of age of newborn encephalopathy: population based study. Arch Did Child Fetal Neonatal Ed2005;90:F257–F261.
8. Himmelmann K, Hagberg G, Uvebranz P et al. Dyskinetic cerebral palsy: a population-based study of children born between 1991 and 1998. Dev Med Child Neurol2007;49:246–51.
9. Goldstein M . The treatment of cerebral palsy: what we know, what we don’t know. J Pediatr2004;145:S42–46.
10. Gluckman PD, Wyatt JS, Azzopardi D et al. Selective head cooling with mild systemic hypothermia after neonatal encephalopathy: multicentre randomized trial. Lancet2005;365:663–70.
11. Shankaran S, Laptook AR, Ehrenkranz RA et al. Whole-body hypothermia for neonates with hyoxic–ischemic encephalopathy. N Engl J Med2005;353:1574–1584.
12. Azzopardi DV, Strohm B, Edwards AD et al. Moderate hypothermia to treat perinatal asphyxial encephalopathy. N Engl J Med2009;361:1349–1358.
13. Olney JW . Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monosodium glutamate. Science1969;166:386–388.
14. Olney JW . Brain damage in infant mice following oral intake of glutamate, asparate or cysteine. Nature1970;227:609–611.
15. Kirino T . Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Res1982;239:57–69.
16. Vannucci RC . Experimental biology of cerebral hypoxia–ischemia: relation to perinatal brain damage. Pediatr Res1990;27:317–326.
17. Delpy DT, Gordon RE, Hope PL et al. Noninvasive investigation of cerebral ischemia by phosphorus nuclear magnetic resonance. Pediatrics1982;70:310–313.
18. Hope PL, Costello AM, Cady EB et al. Cerebral energy metabolism studied with phosphorus NMR spectroscopy in normal and birth-asphyxiated infants. Lancet1984;2:366–370.
19. Blumberg RM, Cady EB, Wigglesworth JS et al. Relation between delayed impairment of cerebral energy metabolism and infarction following transient focal hypoxia ischemia in the developing brain. Exp Brain Res1997;113:130–137.
20. Lorek A, Takei Y, Cady EB et al. Delayed („secondary“) cerebral energy failure after acute hypoxia–ischemia in the newborn piglet: continuous 48-hour studies by phosphorus magnetic resonance spectroscopy. Pediatr Res1994;36:699–706.
21. Simon RP, Swan JH, Griffiths T et al. Blockage of N-methyl-D-aspartate may protect against ischemic damage in the brain. Science1984;226:850–852.
22. Clemence M, Thornton JS, Penrice J et al. 31P MRS and quantitative diffusion and T2 MRI show no cerebroprotective effects of intravenous MgSO4 after severe transient hypoxia–ischemia in the neonatal piglet. MAGMA1996;4:114.
23. Gunn AJ, Mydlar T, Bennet L et al. The neuroprotective actions of a calcium channel antagonist, flunarizine, in the infant rat. Pediatr Res1989;25:573–576.
24. Nabetani M, Okada Y, Takata T et al. Neural activity and intracellular Ca²⁺mobilization in the CA1 area of hippocampal slices from immature and mature rats during ischemia or glucose deprivation. Brain Res 1997;769:158–162.
25. Bagenfolm R, Nilsson UA, Kjellmer I . Formation of free radicals in hypoxic ischemic brain damage in the neonatal rat, assessed by an endogenous spin trap and lipid peroxidation. Brain Res1997;773:132–138.
26. Bagenfolm R, Nilsson A, Gotborg CW et al. Free radicals are formed in the brain of fetal sheep during reperfusion after cerebral ischemia. Pediatr Res1998;43:271–275.
27. McCord JM . Oxyge-derived free radicals in postischemic tissue injury. N Engl J Med1985;312:159–163.
28. Ferriero DM . Neonatal brain injury. N Engl J Med2004;351:1985–1995.
29. Johnston MV, Fatemi A, Wilson MA et al. Treatment advances in neonatal neuroprotection and neurointensive care. Lancet Neurol2011;10:372–382.
30. Northington FJ, Chavez-Valdez R, Martin LJ . Neuronal cell death in neonatal hypoxia–ischemia. Ann Neurol2011;69:743–58.
31. Iwaibara T, Ri S, Nabetani M et al. Studies of quantitative SPECT on bilateral basal ganglia and thalamiclesions (BGTL) in hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). Hot Topics in the neonatology. John Wiley & Sons: Washington DC 2010.
32. Nabetani M, Okada Y . Developmental and regional differences in the vulnerability of rat hippocampal slices to brief and prolonged periods of hypoxia. Dev Neurosci1994;16:301–306.
33. Busto R, Dietrich WD, Globus MY et al. Postishemic moderate hypothermia inhibits CA1 hippocampal ischemic neuronal injury. Neurosci Lett1989;101:299–304.
34. Thoresen M, Bågenholm R, Løberg EM et al. Posthypoxic cooling of neonatal rats provides protection against brain injury. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed1996;74:F3–F9.
35. Sirimanne ES, Edwards AD, Williams CE et al. The effect of prolonged modification of cerebral temperature on outcome after hypoxic–ischemic brain injury in the infant rat. Pediatr Res1996;39:591–597.
36. Takata T, Nabetani M, Okada Y . Effects of hypothermia on the neuronal activity, [Ca²⁺]i accumulation and ATP levels during oxygen and/or glucose deprivation in hippocampal slices of guinea pigs. Neurosci Lett1997;227:41–44.
37. Rosenkranz K, Tenbusch M, Meier C et al. Changes in Interleukin-1 alpha serum levels after transplantation of umbilical cord blood cells in a model of perinatal hypoxic–ischemic brain damage. Ann Anat2013;195:122–127.
38. Wasielewski B, Jensen A, Meier C et al. Neuroglial activation and Cx43 expression are reduced upon transplantation of human umbilical cord blood cells after perinatal hypoxic–ischemic injury. Brain Res2012;1487:39–53.
39. Paton MCB, McDonald CA, Miller SL et al. Perinatal brain injury as a consequence of preterm birth and intrauterine inflammation: designing targeted stem cell therapies. Front Neurosci2017;11:200.
40. Li J, Yawno T, Miller SL et al. Preterm white matter brain injury is prevented by early administration of umbilical cord blood cells. Exp Neurol2016;283:179–87.
41. Hattori T, Sato Y, Hayakawa M et al. Administration of umbilical cord blood cells transiently decreased hypoxic–ischemic brain injury in neonatal rats. Dev Neurosci2015;37:95–104.
42. Rosenkranz K, Kumbruch S, Meier C et al. Transplantation of human umbilical cord blood cells mediated beneficial effects on apoptosis, angiogenesis and neuronal survival after hypoxic–ischemic brain injury in rats. Cell Tissue Res2012;348:429–438.
43. Pimentel-Coelho PM, Magalhaes ES, Mendez-Otero R et al. Human cord blood transplantation in a neonatal rat model of hypoxic–ischemic brain damage: functional outcome related to neuroprotection in the striatum. Stem Cells Dev2010;19:351–358.
44. Yoshihara T, Taguchi A, Matsuyama T et al. Increase in circulating CD34positive cells in patients with angiographic evidence of moyamoya-like vessels.  Cereb Blood Flow Metab2008.;28:1086–1089.
45. Rosenkranz K, Kumbruch S, Meier C et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 contributes to the ‘homing’ of umbilical cord blood cells to a hypoxic–ischemic lesion in the rat brain. J Neurosci Res2010;88:1223–1233.
46. Yasuhara T, Hara K, Borlongan CV et al. Mannitol facilitates neurotrophic factor up-regulation and behavioural recovery in neonatal hypoxic–ischaemic rats with human umbilical cord blood grafts. J Cell Mol Med2010;14:914–921.
47. Majka M, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J et al. Numerous growth factors, cytokines, and chemokines are secreted by human CD34+ cells, myeloblasts, erythroblasts, and megakaryoblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner. Blood2001;97:3075–3085.
48. Taguchi A, Matsuyama T, Moriwaki H et al. Circulating CD34positive cells provide an index of cerebrovascular function. Circulation2004;109:2972–2975.
49. Taguchi A, Soma T, Tanaka H et al. Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. J Clin Invest2004;414:330–338.
50. Asahara T, Murohara T, Sullivan A et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science1997;275:964–967.
51. Asahara T, Masuda H, Takahashi T et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res1999;85:221–228.
52. Jin K, Zhu Y, Sun Y et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulates neurogenesis in vitroand in vivo.  Natl. Acad. Sci USA 2002;99:11946–11950.
53. Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H et al. Therapeutic potential of ex vivoexpanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation 2001;103:634–637.
54. Nakatomi H, Kuriu T, Okabe S et al. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neuronal progenitors. Cell2002;110:429–441.
55. Drago J, Murphy M, Carroll SM et al. Fibroblasts growth factor-mediated proliferations of central nervous system precursors depends on endogenous production of insulin-like growth factor 1. Proc Natl Acad Sci USA1991;88:2199–2203.
56. Kasahara Y, Yamahara K, Taguchi T et al. Transplantation of hematopoietic stem cells: intra-arterial versus intravenous administration impacts stroke outcomes in a murine model. Transl Res2016;176:69–80.
57. Felling RJ, Snyder MJ, Levison SW et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci2006;26:4359–69.
58. Eglitis MA, Mezey E . Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci USA1997;94:4080–5.
59. Mezey E, Key S, Vogelsang G, Lange GD, Crain B . Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains. Proc Natl Acad Sci USA2003;100:1364–9.
60. Li Y, Adomat H, Elizei G et al. Identification of a hematopoietic cell dedifferentiation-inducing factor. J Cell Physiol2016;231:1350–63.
61. Chen SH, Wang JJ, Chio CC et al. Umbilical cord blood-derived CD34⁺cells improve outcomes of traumatic brain injury in rats by stimulating angiogenesis and neurogenesis. Cell Transplant 2014;23:959–79.
62. Davoust N, Vuaillat C, Nataf S et al. Bone marrow CD34+/B220+ progenitors target the inflamed brain and display in vitrodifferentiation potential toward microglia. FASEB J 2006;20:2081–92.
63. Chung S, Rho S, Lew H et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells and chorionic plate-derived mesenchymal stem cells promote axon survival in a rat model of optic nerve crush injury. Int J Mol Med.2016;37:1170–80.
64. Jeffrey M, Perlman Jo, Wyllie JK et al. Neonatal Resuscitation: 2010 International Consensus on Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care Science with treatment Recommendations. Circulation2010;122:S516–S538.
65. Iwata O, Nabetani M, Takenouchi T, Iwaibara T, Iwata S, Tamura M . Hypothermia for neonatal encephalopathy: Nationwide Survey of Clinical Practice in Japan as of August 2010. Acta Paediatr2012;101:e197–202.
66. Takenouchi T, Iwata O, Nabetani M et al. Therapeutic Hypothermia for neonatal encephalopathy: JSPNM & MHLW Japan Working Group Practice Guidelines Consensus Statement from the Working Group on Therapeutic Hypothermia for Neonatal Encephalopathy, Ministry of Health, Labor and Welfare (MHLW), Japan, and Japan Society for Perinatal and Neonatal Medicine (JSPNM). Brain Dev2012;34:165–70.
67. Tsuda K, Nabetani M, Iwata O et al. Therapeutic hypothermia for neonatal encephalopathy: a report from the first 3 years of the Baby Cooling Registry of Japan. Sci Rep2017;7:39508.
68. Nabetani M . Hypothermia therapy and autologous cord blood therapy for newborns with HIE in Japan. PAS Topic Symposium, 2 May 2016, Baltimore, MD.
69. Shankaran S, Laptook AR, Pappas A et al. Effect of depth and duration of cooling on deaths in the NICU among neonates with hypoxic ischemic encephalopathy: a randomized clinical trial. JAMA2014;312:2629–39.
70. Nakahata T, Ogawa M . Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. J Clin Invest1982;70:1324–8.
71. Rafii S, Lyden D . Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med2003;9:702–712.
72. Murohara T, Ikeda H, Duan J et al. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest2000;105:1527–1536.
73. Sun J, Allison J, Kurtzberg J et al. Differences in quality between privately and publicly banked umbilical cord blood units: a pilot study of autologous cord blood infusion in children with acquired neurologic disorders. Transfusion2010;50:1980–1987.
74. de Paula S, Greggio S, DaCosta JC et al. The dose-response effect of acute intravenous transplantation of human umbilical cord blood cells on brain damage and spatial memory deficits in neonatal hypoxia–ischemia. Neuroscience2012;210:431–441.
75. Michejda M . Which stem cells should be used for transplantation? Fetal Diagn Ther2004;19:2–8.
76. Locatelli F, Rocha V, Chastang C et al. Cord blood transplantation for children with acute leukemia. Eurocord Transplant Group. Bone Marrow Transplant1998;21 (Suppl 3): S63–S65.
77. Tezuka K, Nakayama H, Honda K et al. Treatment of a child with myeloid/NK cell precursor acute leukemia with L-asparaginase and unrelated cord blood transplantation. Int J Hematol2002;75:201–6.
78. de Medeiros CR, Silva LM, Pasquini R . Unrelated cord blood transplantation in a Fanconi anemia patient using fludarabine-based conditioning. Bone Marrow Transplant2001;28:110–2.
79. Lindvall O, Kokaia Z . Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature2006;441:1094–1096.
80. Sato Y, Oohira A . Chondroitin sulfate, a major niche substance of neural stem cells, and cell transplantation therapy of neurodegeneration combined with niche modification. Curr Stem Cell Res Ther2009;4:200–209.
81. Meier C, Middelanis J, Jensen A et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Pediatr Res2006;59:244–249.
82. Cox CS Jr, Baumgartner JE, Gee A et al. Autologous bone marrow mononuclear cell therapy for severe traumatic brain injury in children. Neurosurgery2011;68:588–600.
83. Wang X, Cheng H, An Y et al. Effects of bone marrow mesenchymal stromal cells on gross motor function measure scores of children with cerebral palsy: a preliminary clinical study. Cytotherapy2013;15:1549–62.
84. Sharma A, Sane H, Badhe P et al. A clinical study of autologous bone marrow mononuclear cells for cerebral palsy patients: a new frontier. Stem Cells Int2015;2015:905874.
85. Min K, Song J, Kim M et al. Umbilical cord blood therapy potentiated with erythropoietin for children with cerebral palsy: a double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Stem Cells2013;31:581–91.
86. Mehta T, Feroz A, Trivedi H et al. Subarachnoid placement of stem cells in neurological disorders. Transplant Proc2008;40:1145–7.
87. Mancías-Guerra C, Marroquín-Escamilla AR, Gómez-Almaguer D et al. Safety and tolerability of intrathecal delivery of autologous bone marrow nucleated cells in children with cerebral palsy: an open-label phase I trial. Cytotherapy2014;16:810–20.
88. Rizk M, Aziz J, Allan DS et al. Cell-based therapy using umbilical cord blood for novel indications in regenerative therapy and immune modulation: an updated systematic scoping review of the literature. Biol Blood Marrow Transplant2017;23:1607–1613.
89. Tsuji M, Taguchi A, Ohshima M et al. Effects of intravenous administration of umbilical cord blood CD34(+) cells in a mouse model of neonatal stroke. Neuroscience2014;263:148–58.
90. Bennet L, Tan S, Gunn AJ et al. Cell therapy for neonatal hypoxia–ischemia and cerebral palsy. Ann Neurol2012;71:589–600.
91. Ingram DA, Mead LE, Yoder MC et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood2004;104:2752–2760.
92. Lee OK, Kuo TK, Chen TH et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood2004;103:1669–1675.
93. Cotten MC, Tan S, Kurtzberg J et al. Feasibility of autologous cord blood cells for infants with hypoxic–ischemic encephalopathy. J Pediatr2014;164:973–979.
94. Kim JP, Lee YH, Kim YD et al. A comparison of the kinetics of nucleated cells and CD34+ cells in neonatal peripheral blood and cord blood. Biol Blood Marrow Transplant2007;13:478–485.